麥曲在黃酒釀造中起著重要的作用。分析微生物在麥曲中的區(qū)系分布和其中微生物菌群的系統(tǒng)發(fā)育，對于理順麥曲中的微生物與產(chǎn)地環(huán)境的相互關(guān)系、建立麥曲微生物生態(tài)數(shù)據(jù)庫和麥曲品質(zhì)的分子評價指標，具有重要的指導(dǎo)意義。

不同培養(yǎng)基進行真菌平板分離的結(jié)果

    　為了最大限度地分離出麥曲中的真菌，采用了三種培養(yǎng)基，其中PDA和CPK培養(yǎng)基是用來分離真菌的常用培養(yǎng)基，此外還使用了麥曲浸提液培養(yǎng)基（WQE），因為它的營養(yǎng)成份近似于微生物最原始的生存環(huán)境。對于三種培養(yǎng)基進行平板菌落計數(shù)，PDA和WQE培養(yǎng)基上的菌落數(shù)在48小時后達到最大，菌落數(shù)分別達到4.7×104cfu/g干曲和8.4×104cfu/g干曲。而在CPK培養(yǎng)基上，由于本身是合成培養(yǎng)基，營養(yǎng)不夠豐富，所以24小時后開始慢慢形成菌落，56小時后達到最大值，僅為1.4×104 cfu/g干曲。

不同培養(yǎng)基的麥曲真菌分布

    　根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色等表型特征進行初步區(qū)分，共得到24株純種菌株。各個純株在3種分離培養(yǎng)基上的分布情況見表1。從PDA，CPK和WQE三種培養(yǎng)基上分離得到的純種真菌分別為8種、18種和11種。PDA是營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，但分離出來的真菌數(shù)目最少。而近似于微生物最原始生存環(huán)境的WQE培養(yǎng)基分離得到的真菌種類，要比預(yù)期的少。在合成培養(yǎng)基CPK上分離獲得的真菌種類最多，暗示在低營養(yǎng)長時間的培養(yǎng)條件下，能夠較多地回收得到麥曲樣品中的真菌。

    　將10—5稀釋度以上檢測到的真菌認為是麥曲樣品中的優(yōu)勢菌。從表中可以看出，不同的培養(yǎng)基分離出來的優(yōu)勢菌是不一樣的，且每一種培養(yǎng)基都能檢測到其它培養(yǎng)基所不能檢測到的優(yōu)勢菌株，所以必須聯(lián)合使用多種分離培養(yǎng)基，才能準確解析麥曲中的真菌多樣性。另外，在分離培養(yǎng)基中有必要加入去氧膽酸鈉來抑制菌絲的蔓延。

純種真菌的鑒定

    　對分離獲得的24株真菌純株進行形態(tài)初步鑒定和基于ITS序列的分子鑒定，具體測序結(jié)果見表1。

    　綜合平板分離和測序的結(jié)果可以看出，通過大規(guī)模的系統(tǒng)分離培養(yǎng)方法確定麥曲中的優(yōu)勢真菌為：傘枝犁頭霉（Absidia corymbifera—like），米曲霉（Aspergillus oryzae）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、黑曲霉（Aspergillus.niger）、小孢根霉（Rhizopus microsporus）、微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）、季氏畢赤氏酵母（Pichia guilliermondii）和異常畢赤酵母（Pichia anomala）。
    本研究分離鑒定出的焦曲霉(Aspergillus ustus)、土曲霉（Aspergillus terreus—like）、泡盛曲霉（Aspergillus awamori）、桔青霉（Penicillium citrimum）、季氏畢赤酵母、異常畢赤酵母，小孢根霉，多變根毛霉（Rhizomucor variabilis）、球毛殼霉（Chaetomium globasum）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）和Phaeosphaeria fuckelii等菌株在以前的研究結(jié)果中均未出現(xiàn)。所用的麥曲是人工腳踏成型，此前公司采用培養(yǎng)法對機制麥曲中的真菌進行過研究，機制麥曲中的優(yōu)勢真菌為傘枝犁頭霉(Absidia corymbifera)、米根霉(Rhizopus oryzae)、微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。除了米根霉以外，其余優(yōu)勢真菌與本文的研究結(jié)果一致。

    　人工腳踏成型麥曲中的真菌種類比機械壓制成型麥曲豐富，其原因是人工踩制曲坯能起到提漿作用，賦予曲坯表面較豐富的營養(yǎng)和較好的保溫功能，因而比機械壓制成型的曲坯更適合微生物的生長繁殖。

    　對分離獲得的真菌純株序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，所分離得到的純種菌株大致分為11個屬，分別是曲霉屬（Aspergillus）、犁頭霉屬（Absidia）、根霉屬（Rhizopusmucor）、毛霉屬（Rhizopus）、青霉屬（Penicillium）、散囊菌屬(Eurotium)、枝孢屬（Cladosporium）、畢赤酵母屬（Pichia）、球毛殼屬（Chaetomium）、念珠屬(Candida)和伊薩酵母屬（Issatchenkia），反映出紹興黃酒成品麥曲中真菌的資源非常豐富。從屬的分類水平來看，在腳踏曲中出現(xiàn)的屬除了散囊菌屬（Eurotium）、畢赤酵母屬（Pichia）和球毛殼屬（Chaetomium）外，其它的屬在機制曲中均有出現(xiàn)。  　
 

   　本文所得到的序列用菌名加代號表示，來自于GenBank數(shù)據(jù)庫的序列用菌名加登錄號表示。比例尺代表5%的核酸序列差異性。

核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因間隔區(qū)
分析麥曲中真菌群落構(gòu)成

    　免培養(yǎng)法提取麥曲中微生物總DNA顯示了9條帶，其中條帶8、條帶5、條帶4 和條帶3，亮度最高。免培養(yǎng)法指紋圖譜中的條帶，經(jīng)過回收后的測序結(jié)果見表2。

　　采用分子生物學技術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)富集法分析麥曲中真菌的RISA指紋圖譜有明顯的差異。免培養(yǎng)法指紋圖譜中檢測到的9條帶，其中5條帶所代表的微生物（Absidia corymbifera, Rhizomucor pusillus、 Aspergillus oryzae、 Emericella nidulans、Clavispora lusitaniae）通過培養(yǎng)法分離得到。對應(yīng)于條帶3，條帶7和條帶8的真菌熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、 米根霉（Rhizopus oryzae）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），通過分離培養(yǎng)法沒有檢出。

    　造成上述現(xiàn)象的原因可能是：　　　　　　　　　　　

　　第一、所用培養(yǎng)基的選擇性；第二、麥曲中其他真菌的抑制；第三、經(jīng)過制曲過程中的高溫選擇后。這3種真菌在最終的成品麥曲中沒有活細胞，但是用不辨別死活細胞的免培養(yǎng)法可以檢測出來。另外，通過不同的分離培養(yǎng)基檢測出的19株真菌通過免培養(yǎng)法未能檢測到，可能是由免培養(yǎng)技術(shù)本身引起的。

　　據(jù)悉，一方面，在樣品中的含量低于1%的微生物通過免培養(yǎng)法無法檢測到，而這些含量比較低的微生物通過培養(yǎng)法可以檢測到；另一方面，有些微生物在樣品中的含量很少，但通過培養(yǎng)基富集后，其數(shù)量增加，以致于通過RISA技術(shù)被檢測出來，從而在液態(tài)富集的指紋圖譜中出現(xiàn)。

　　因此，為了更加準確的認識麥曲中的真菌群落結(jié)構(gòu)，應(yīng)該聯(lián)合使用培養(yǎng)法和分子生物學技術(shù)。通過培養(yǎng)法未能得到的序列；由于技術(shù)原因，條帶2未能檢測到。
 

   　綜合分析免培養(yǎng)法和培養(yǎng)法檢測黃酒麥曲中真菌的結(jié)果，初步認為麥曲中的主要真菌為：傘枝犁頭霉、米曲霉、煙曲霉、黑曲霉、小孢根霉、微小根毛霉、季氏畢赤氏酵母、異常畢赤酵母、米根霉、釀酒酵母、熱帶假絲酵母文章來源華夏酒報、構(gòu)巢裸孢殼及葡萄牙念珠菌。

純種真菌的顯微圖片