啤酒糟是啤酒工業(yè)中的主要副產(chǎn)物，是以大麥為原料，經(jīng)發(fā)酵提取籽實中可溶性碳水化合物后的殘渣。在國內(nèi)，啤酒糟主要作為飼料被直接使用，利用效率很低。啤酒糟中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維，氨基酸、糖類和多種微量元素，是良好的天然培養(yǎng)基，不僅可以發(fā)酵生產(chǎn)一些蛋白飼料，同時也可以用于工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)。啤酒糟的再利用，可以增加啤酒工業(yè)的附加值，降低其生產(chǎn)成本。

   文章來源華夏酒報; 　β—葡萄糖苷酶又稱β—D—葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它可以水解糖鏈末端非還原性的β—D—葡萄糖苷鍵。β—葡萄糖苷酶是纖維素酶的主要組成成分，直接影響著纖維素酶的降解能力。

　　此外，β—葡萄糖苷酶在食品行業(yè)中也有著廣泛的應(yīng)用，如作為水果和茶葉的風(fēng)味酶，水解大豆異黃酮甙元等。β—葡萄糖苷酶存在于自然界很多植物中，也存在于酵母、曲霉屬、木霉屬及一些細(xì)菌中。黑曲霉是公認(rèn)安全的微生物之一, 在纖維物質(zhì)的誘導(dǎo)下，黑曲霉可產(chǎn)生胞外β—葡萄糖苷酶。

　　筆者研究了黑曲霉固態(tài)發(fā)酵啤酒糟產(chǎn)β—葡萄糖苷酶的工藝條件，同時探討了β—葡萄糖苷酶合成的動力學(xué)機(jī)制，望能為啤酒糟的再利用提供一定數(shù)據(jù)依據(jù)。

    　1 材料和方法
    　1.1 菌種
    　黑曲霉購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。
    　1.2 試劑和設(shè)備
    　1.2.1 主要試劑
    　啤酒糟由蚌埠學(xué)院生物與食品工程系啤酒發(fā)酵實驗室提供；
    　水楊苷（進(jìn)口分裝）、微晶纖維素（進(jìn)口分裝）、羧甲基纖維素鈉（CMC）、 3， 5—二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚。
    　1.2.2 主要設(shè)備
    　752分光光度儀（上海菁華科技儀器有限公司）、DH Z—D冷凍恒溫振蕩器（江蘇太倉市實驗設(shè)備廠）、SFAT—8000固態(tài)發(fā)酵罐（常州新區(qū)三環(huán)生物工程成套設(shè)備有限公司）。

    　1.3 培養(yǎng)基
    　斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；
    　發(fā)酵培養(yǎng)基：啤酒糟5g置于500ml 三角瓶中，用基本培養(yǎng)液調(diào)初始含水量，121℃滅菌20min。

    　1.4 試驗方法
    　1.4.1 粗酶液的制備
    　黑曲霉在無菌條件下接入斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72h。每100ml  無菌水接入1環(huán)孢子配置種子懸浮液( 1.15×106 /ml )。按一定料液比將種子懸浮液接入滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)96h。用100ml去離子水浸提培養(yǎng)基，攪拌1h，抽濾，在3000r/min條件下離心15min，收集上清液，即為粗酶液。
    　1.4.2 單因素分析
    　在其他條件不變的情況下，分別測定不同溫度、料液比和接種量對β—葡萄糖苷酶酶活的影響。
    　1.4.3 正交分析
    　利用L9( 34 )正交試驗優(yōu)化β—葡萄糖苷酶的發(fā)酵條件。
    　1.4.4 動力學(xué)研究
    　發(fā)酵過程中，每隔24h分別測定發(fā)酵培養(yǎng)基中Cx 酶、β—葡萄糖苷酶和C1酶的活性，分析β—葡萄糖苷酶酶活隨時間的變化情況。

    　1.5 酶活力的測定
    　1.5.1 β—葡萄糖苷酶活力的測定。取4支洗凈烘干的10ml具塞刻度試管， 編號后各加入1.5ml0.5%水楊酸苷檸檬酸緩沖液，向1號試管中加入1.5mlDNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照，比色時調(diào)零用。將4支試管同時在50℃水浴中預(yù)熱5min—10min，再各加入酶液0.5ml，50℃水浴中保溫30min，取出后立即分別向2、3 和4號試管中加入1.5ml DNS 溶液以終止酶反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴5min，取出冷卻后用蒸餾水定容至10ml，充分混勻。
    　以1號試管溶液為空白對照調(diào)零點，測定2、3和4號試管液的吸光度值并記錄結(jié)果。定義在測定條件下，1min內(nèi)水解水楊酸苷生成1μmol葡萄糖所需的酶量為一個酶活單位（U）。

    　1.5.2 葡萄糖內(nèi)切酶（CX）活力的測定 以羧甲基纖維素鈉為底物，方法同上。
    　1.5.3 葡萄糖外切酶（C1）活力的測定 以微晶纖維素為底物，方法同上。
    　1.5.4 還原糖的測定 采用DNS（3，5—二硝基水楊酸）法。

    　2 結(jié)果與分析

    　2.1單因素分析
    　溫度是黑曲霉生長的重要條件之一，它不僅影響著菌體的生長速率，同時也制約著代謝產(chǎn)物的水平。在30℃條件下，β—葡萄糖苷酶的活力最高，而40℃時酶活最低。值得注意的是，從培養(yǎng)基孢子生長情況上看，25℃條件下，黑曲霉產(chǎn)生的孢子稀疏，主要以菌絲體為主；而在37℃條件下，孢子生長的十分密集，但兩者β—葡萄糖苷酶的酶活相差不是很大。

    　這一現(xiàn)象表明，兩種產(chǎn)酶機(jī)制的不同，25℃更適合β—葡萄糖苷酶的生成，而37℃時，雖然產(chǎn)酶水平不高，但孢子數(shù)量巨大，產(chǎn)生的總酶活也高。
    　在固態(tài)發(fā)酵中，初始含水量主要影響著菌體對氧氣的攝取。按料液比（培養(yǎng)基：水，g/ml）1：5配置培養(yǎng)基的初始含水量時酶活最高。當(dāng)含水量過高時，由于限制了培養(yǎng)基對氧的攝取，產(chǎn)酶水平開始下降。

    　在一定范圍內(nèi)，隨著接種量的增大，酶活逐漸變大，當(dāng)接種量增大到10%以上后，酶活變化減小，這可能是由于菌種數(shù)量過大，導(dǎo)致培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的迅速消耗，從而影響酶的產(chǎn)量（見表2）。

    　2.2正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝
    　利用正交表設(shè)計L9（ 34 ）正交試驗, 溫度的三個水平分別為25℃、30℃和37℃；含水量分別為1：1、1：3 和1：5；接種量為2%、5%和10%（見表1）。

    　可以看出, 在25℃、含水量1：5和接種量10%的條件下, 酶活達(dá)到10.85U / g；其中含水量對β—葡萄糖苷酶酶活具有顯著的線型相關(guān)（ p< 0.05）。

　　2.3 葡萄糖苷酶的合成特性
    　葡萄糖苷酶是纖維素酶的重要組成成分，在很大程度上決定著纖維素酶的活性。以啤酒糟為培養(yǎng)基，在30℃，接種量10%和料液比1：5的條件下，利用固態(tài)發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，每隔24h測定黑曲霉產(chǎn)β—葡萄糖苷酶， 繪制各種酶的酶活變化曲線。

    　Cx酶在72h時達(dá)到產(chǎn)酶的高峰期，而β—葡萄糖苷酶的酶活則繼續(xù)增大。在96h后，β—葡萄糖苷酶酶活的增幅變小，這一現(xiàn)象可能說明，在96h時該酶已經(jīng)進(jìn)入產(chǎn)酶的高峰期；此后，由于菌絲體發(fā)生自溶，胞內(nèi)的β—葡萄糖苷酶釋放到培養(yǎng)基中，使酶活進(jìn)一步變大。利用啤酒糟作為培養(yǎng)基，β— 葡萄糖苷酶的酶活要遠(yuǎn)高于Cx酶，而用其它培養(yǎng)基時，Cx酶的酶活要高于β—葡萄糖苷酶，這表明啤酒糟適合于β—葡萄糖苷酶的發(fā)酵生產(chǎn)。

    　3 結(jié)論

    　目前，β—葡萄糖苷酶主要是利用微生物發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)，尤其是黑曲霉和米曲霉，培養(yǎng)基多為麩皮、蛋白胨和各種無機(jī)鹽。

　　有研究表明，初始pH值對于β—葡萄糖苷酶的產(chǎn)量有著重要的影響。

    　啤酒糟富含各種營養(yǎng)成分，有利于誘導(dǎo)β—葡萄糖苷酶的產(chǎn)生，可能成為該酶發(fā)酵生產(chǎn)的天然培養(yǎng)基。實驗表明，在25℃，料液比1：5和接種量10%的固態(tài)發(fā)酵條件下，酶活可達(dá)到10.85U / g；動力學(xué)研究顯示，β—葡萄糖苷酶在96h進(jìn)入產(chǎn)酶高峰期，120h時達(dá)到酶活最高值。此外，發(fā)酵后的啤酒糟由于纖維結(jié)構(gòu)被破壞，從而更容易被動物吸收，可能成為較好的有機(jī)飼料。