摘要：以黃黏土、藕塘泥、豆餅粉、大曲粉、鮮酒糟、黃漿水、酒尾、脫水活性窖泥功能菌等為原料，制備一種濃香型酒人工窖泥，通過窖泥宏基因組DNA提取，建立16SrDNA、18SrDNA文庫(kù)，

然后對(duì)該窖泥16SrDNA、18SrDNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，最后進(jìn)行微生物多樣性分析。

關(guān)鍵詞：人工窖泥；制備；微生物；多樣性分析
 

中國(guó)白酒有上千年的釀造歷史，具有鮮明的地域特色，是世界六大蒸餾酒之一。

俗話說(shuō)“千年窖池萬(wàn)年糟”、“生香靠發(fā)酵，提香靠蒸餾”，作為中國(guó)大部分白酒發(fā)酵載體的窖池，在白酒生產(chǎn)過程中無(wú)疑起到舉足輕重的作用。酒醅在窖池中密封厭氧發(fā)酵，酒醅、少量遺留空氣、窖池共同參與了這一完整發(fā)酵過程，窖池的優(yōu)劣，窖泥里含有的微生物種類及豐富程度直接影響著后期蒸餾白酒的質(zhì)量，優(yōu)質(zhì)的窖泥對(duì)白酒生產(chǎn)至關(guān)重要。

1材料

1.1黃黏土5.03

要求：土質(zhì)較純，含沙量低，粘度較大。

1.2藕塘泥5.03

要求：種植蓮藕5年以上，塘泥無(wú)污染，無(wú)異雜物，含沙量低。

1.3豆餅粉200kg

要求：粉碎成面。

1.4大曲粉500kg

要求：中溫曲，外觀、指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，粉碎成面。

1.5鮮酒糟500kg

要求：當(dāng)日或前一日蒸酒后丟糟。

1.6黃漿水500kg

1.7濃香酒尾700kg

要求：按30%vol標(biāo)準(zhǔn)折算。

1.8專用輔料70kg

1.9脫水活性窖泥功能菌180kg

2窖泥制備

2.1脫水活性窖泥功能菌活化液的制備

在陶壇中按l：6（40°C～45°C）的溫水比例，將功能菌加水活化，在28°C～35°C的條件下，保溫活化4小時(shí)，在活化過程中每小時(shí)至少應(yīng)攪拌一次。

2.2專業(yè)輔料液（制備方法同2.1）

2.3將粘黃土、藕塘泥打散，除去雜物，然后按配方要求做好計(jì)量，放置在窖泥制備場(chǎng)所。

2.4將各種固體材料混合折成堆，并翻拌均勻，然后攤平厚約30～40公分的方（圓）堆。

2.5將酒尾、黃漿水混合液（用氨水或碳酸銨調(diào)整PH6.5～6.8）和功能菌活化液，專用輔料液噴灑在堆面上，邊灑邊拌合，直至合熟為止，然后經(jīng)打泥機(jī)第一次打泥。

2.6將合熟的混合泥運(yùn)至窖泥專用發(fā)酵池旁，再次經(jīng)打泥機(jī)直接打入池中，入池溫度控制在30°C～35°C，PH6.5～7.0。池子裝泥量應(yīng)低于池口沿20～30公分為宜。

2.7入完后將池口泥扒平，表面灑入含1.5%vol的酒液8～10公斤作為液封。上面蓋好塑料布，周邊用土壓實(shí)，進(jìn)行厭氧發(fā)酵30～40天。

3微生物多樣性分析

3.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

對(duì)窖泥樣本進(jìn)行miseq文庫(kù)制備（基因組DNA抽提、PCR擴(kuò)增，AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒回收，及FTC-3000TM real-time PCR儀）。而后進(jìn)行illumina miseq 2x300 bp 高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析。

3.2原核微生物項(xiàng)目結(jié)果報(bào)告

3.2.1測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3.2.2多樣性指數(shù)分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3.2.3稀釋性曲線

3.2.4窖泥原核微生物分析

通過窖泥宏基因組DNA提取，并建立16SrDNA 文庫(kù)，然后對(duì)該窖泥16SrDNA 文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序有效序列條數(shù)為94017；獲得45480個(gè)Reads，分成729個(gè)OTU。通過聚類結(jié)果可以得到該窖泥種菌群分布如下：

優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門（Firmicutes）占比98.29%，其次為放線菌和變形菌；97.65%均為梭菌綱梭菌目；繼續(xù)分類，總序列的94.49%為瘤胃菌科；但是具體到菌的種和屬，根據(jù)目前數(shù)據(jù)庫(kù)比較，90%以上為未分類的種和屬，及部分雖然能分類但屬于未培養(yǎng)細(xì)菌。所以該窖泥具有開發(fā)新菌種及新基因序列的潛力。

根據(jù)窖泥研究文獻(xiàn)瘤胃菌科細(xì)菌是產(chǎn)己酸的主要菌種，而正己酸和乙醇形成正己酸乙酯是濃香型白酒重要的香型物質(zhì)；該己酸菌類未在數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到種和屬，說(shuō)明此窖泥可能具有獨(dú)特的己酸菌菌種，可能產(chǎn)生自己獨(dú)特風(fēng)味的濃香型白酒。

3.3 真核微生物項(xiàng)目結(jié)果報(bào)告

3.3.1測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3.3.2多樣性指數(shù)分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3.3.3稀釋性曲線

3.3.4窖泥真核微生物分析

通過窖泥宏基因組DNA提取，建立18SrDNA 文庫(kù)，然后對(duì)該窖泥18SrDNA 文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序有效序列條數(shù)為70436；獲得35282個(gè)Reads，分成883個(gè)OTU。通過聚類結(jié)果可以得到該窖泥種菌群分布如下：

真核生物比較豐富，主要集中在綠藻門37.10%、輪形動(dòng)物門18.49%、鏈形植物門13.27%等。優(yōu)勢(shì)物種為Prototheca zopfii（左氏原壁菌），根據(jù)文獻(xiàn)對(duì)窖泥的研究，該窖泥中所出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)真核物種對(duì)白酒釀造過程的作用未見報(bào)道。

4結(jié)論

從微生物分析的最終結(jié)果看，此次制備的濃香窖泥中，其優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門、梭菌綱梭菌目、瘤胃菌科，而瘤胃菌科細(xì)菌正是產(chǎn)己酸的主要菌種。在發(fā)酵過程中，對(duì)己酸乙酯的生成起到主要作用，而且己酸乙酯是濃香型白酒典型的香味物質(zhì)。該次制備的窖泥性能的優(yōu)劣，我們將在以后的生產(chǎn)實(shí)踐中做進(jìn)一步的研究。

（注：文章中的分析數(shù)據(jù)均摘自華東理工大學(xué)魯華生物技術(shù)研究所出具的山東景陽(yáng)岡酒廠有限公司窖泥微生物多樣性分析報(bào)告。）